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transfection 程序
使用 这 下列的 程序 至 transfect mammalian cells 在 一个
24-好 format
. 至 transfect cells 在 其它 formats, 看
范围调整
向上 或者 向下 transfections
.
1.
adherent cells:
一个 日 在之前 transfection, 加设护板 0.5-2 x 10
5
cells 在 500
µ
l 的 growth 中等 没有 antibiotics 每
好 所以 那 它们 将 是 90-95% confluent 在 这 时间 的 transfection.
suspension cells:
在 这 日 的 transfection just prior 至 preparing complexes, 加设护板 4-8 x 10
5
cells 在 500
µ
l 的 growth
中等 没有 antibiotics 每 好.
2.
为 各自 transfection 样本
, prepare dna-lipofectamine
™
2000 complexes 作 跟随:
一个. dilute dna 在 50
µ
l 的 opti-mem
®
i 减少 serum 中等 没有 serum(或者 其它 中等 没有 serum). 混合
gently.
b. 混合 lipofectamine
™
2000 gently 在之前 使用, 然后 dilute 这 适合的 数量 在 50
µ
l 的 opti-mem
®
i 中等 (或者
其它 中等 没有 serum). 混合 gently 和 incubate 为 5 分钟 在 房间 温度.
便条:
联合的 这
diluted lipofectamine
™
2000 和 这 diluted dna 在里面 30 分钟.变长 incubation 时间 将 decrease
activity. 如果 d-mem 是 使用 作一个 diluent 为 这 lipofectamine
™
2000, 混合 和 这 diluted dna 在里面 5 分钟.
c. 之后 这 5 分钟 incubation, 联合的 the diluted dna 和 这diluted lipofectamine
™
2000 (总的 容积 是
100
µ
l). 混合 gently 和 incubate 为 20 分钟 在 room 温度 至 准许 这 dna-lipofectamine
™
2000
complexes 至 表格. 这 解决方案 将 呈现 cloudy, 但是 这个 将 不 inhibit 这 transfection.
便条:
dna-
Lipofectamine
™
2000 complexes 是 稳固的 为 6 小时 在 房间 温度.
3. 增加 这 100
µ
l 的 dna-lipofectamine
™
2000 complexes 至 各自 好 containing cells 和 中等. 混合 gently 用 rocking
这 加设护板 后面的 和 forth.
4. incubate 这 cells 在 37°c 在 一个 co
2
incubator 为 24-48 小时 直到 它们 是 读y 至 assay 为 transgene expression. 它 是
不 需要 至 除去 这 complexes 或者 改变 这 中等; 不管怎样, growth 中等 将 是 replaced 之后 4-6 小时
没有 丧失 的 transfection activity.
5.
为 稳固的 cell 线条:
passage 这 cells 在 一个 1:10 或者 higher dilution 在 fresh growth中等 24 小时 之后 transfection.
增加 选择性的 中等 这 下列的 日.
为 suspension cells:
增加 pma 和/或者 pha (如果 desired) 4 小时 之后 adding 这 dna-lipofectamine
™
2000 complexes
至 这 cells.
tip:
为 jurkat cells, adding pha-l 和pma 在 最终 concentrations 的 1
µ
g/ml 和 50 ng/ml, 各自,
enhances cmv promoter activity 和gene expression. 为 k562 cells, addingpma alone 是 sufficient 至 增强
promoter activity.
范围调整 向上 或者 向下 transfections
至 transfect cells 在 不同的 tissue cultureformats, 相异 这 amounts 的 lipofectamine
™
2000, dna, cells, 和 中等 使用
在 份额 至 这 区别 在 surface 范围 (看 表格). 和 automated, 高-throughput systems, 大 complexing
volumes 是 推荐 为 transfections 在 96-好 plates.
便条:
你 将 执行 迅速 96-好 加设护板 transfections (加设护板
cells 和 transfect 同时发生地) 用 adding 一个 suspension 的 cells 直接地 至 complexes 准备好 在 这 加设护板. prepare
complexes 和 增加 cells 在 两次 这 cell density 作 在 这 基本 协议 在 一个 100
µ
l 容积. cells 将 adhere 作 在 这
存在 的 dna-lipofectamine
™
2000 complexes.
Culture
Vessel
表面 范围
每 好 (cm
2
)
相关的 表面
范围 (vs. 24-好)
容积 的 镀层
中等
dna (
µ
g) 和
dilution 容积 (
µ
l)
Lipofectamine
™
2000 (
µ
l)
和 dilution 容积 (
µ
l)
96-好 0.3 0.2
100
µ
l 0.2
µ
g 在 25
µ
l 0.5
µ
l 在 25
µ
l
24-好 2 1
500
µ
l 0.8
µ
g 在 50
µ
l 2.0
µ
l 在 50
µ
l
12-好 4 2 1 ml
1.6
µ
g 在 100
µ
l 4.0
µ
l 在 100
µ
l
35-mm 10 5 2 ml
4.0
µ
g 在 250
µ
l 10
µ
l 在 250
µ
l
6-好 10 5 2 ml
4.0
µ
g 在 250
µ
l 10
µ
l 在 250
µ
l
60-mm 20 10 5 ml
8.0
µ
g 在 0.5 ml 20
µ
l 在 0.5 ml
10-cm 60 30 15 ml
24
µ
g 在 1.5 ml 60
µ
l 在 1.5 ml
便条:
表面 areas 是 决定 从 真实的度量 的 tissue culture vessels.
optimizing transfection
至 获得 这 最高的 transfection efficiency 和 低 非-明确的 影响, 优化transfection 情况 用 varying dna
和 lipofectamine
™
2000 concentrations, 和 cell 密度. 制造 确信 th在 cells 是 更好 比90% confluent 和 相异
dna (
µ
g):lipofectamine
™
2000 (
µ
l) ratios 从 1:0.5 至 1:5.
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